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綠如藍核酸染料 (UV).5mL操作步驟

發布時間:2023-06-07      點擊次數:35

綠如藍核酸染料 (UV).5mL操作步驟:

切取含有目的DNA 片段的瓊脂糖凝膠條帶。

   ● 盡量切除不含有目的DNA 部分的凝膠,減少凝膠體積,提高DNA 回收率。

   ● 切膠時,請使用長波長UV  (360 nm )光盒。且不要將DNA 長時間暴露在紫外燈下,以防DNA 損傷。

2  稱取凝膠的重量近似地確定其體積。

   ● 凝膠重量的稱量方法:取.5 ml 離心管電子天平稱初質量,切膠裝在離心管后稱終質量,兩者差即為膠的質量。不同離心管的重量可能有差異,因此,每個離心管的重量需單獨稱量。

3  按照每00 mg 瓊脂糖凝膠對應00 μl 溶液BD 的比例,向離心管中加入溶液BD。

4  50 ℃水浴7-0min,直至凝膠*溶化。期間需要振蕩混合3 次。

   ● 瓊脂糖必須*融化,以免堵塞柱子,嚴重影響DNA 段的回收效率。

   ● 如果總體積大于500 μl,可適當增加溶膠時間。

   ● 若此時溶液變紅,可加0 μl 3M NaAC  (pH 5.2)。

5  將步驟4 所獲溶液置于DNA 純化柱中,靜置2min 。

   ● 膠塊*溶解后將膠溶液溫度降至室溫再上柱,因為純化柱在較高溫度時結合DNA  的能力較弱。

6  2,000 rpm 離心min。若溶液量大于DNA 純化柱的容積,可分兩次離心,棄濾液。

   ● 此時DNA 被吸附于DNA 純化柱中的硅膠膜上。

7  加入500 μl 溶液BD。2,000 rpm,  離心min,棄濾液

8  加入500 μl 溶液PE。2,000 rpm,  離心min,棄濾液。

   ● 溶液PE 初次使用前用無水乙醇按: 4 稀釋,即含80% 乙醇。

   ● 此步驟的作用是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質洗脫,以獲得高質量DNA 段。

9  加入500 μl 溶液PE。2,000 rpm,  離心min,棄濾液。

0 2,000 rpm 離心  3min ,以*去除純化柱中的液體。

   ● 此步驟的作用是去除殘留乙醇,避免殘留乙醇影響后續酶促反應。同時也利于DNA 段的充分溶解。

  將離心柱置于新的.5 ml 離心管中。向純化柱的處,懸空滴加30-00 μl 溶液Eluent  (60℃預熱),靜置2min 。2,000 rpm  離心min,管底即為目的DNA 段。貯存于-20℃。

   ● 溶液Eluent 可用無菌雙蒸水代替,但其pH 需為8.0-8.5,加入體積視DNA 目的段的多少、用戶對目的濃度要求而定。

   ● 對溶液Eluent 60℃預熱,會提高提取DNA 目的段的產量。

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